細胞成像中常用熒光探針介紹(一)



分子熒光探針極大地提升了人們探索細胞結構和細胞過程的能力。它是指能夠吸收某個特定波長的光并發射出更長波長的光(熒光)的化學基團。活細胞成像技術正是利用這些熒光探針,比如小分子有機染料或者量子點來特異性的標記感興趣的分子。能與蛋白質天然或者人工連接的熒光探針都會在熒光成像中用到。熒光基團發展的趨勢在于增加其亮度,減少細胞毒性并使得細胞成像獲得高信噪比。使用熒光探針的另外一個要點是要確保它們在進入細胞時不會對細胞造成損傷。探針進入細胞的方法包括:將染料脂化以促進細胞對其吸收,使用合成囊泡來包裹探針以及使用機械的方法例如顯微注射和電穿孔等。

熒光蛋白

     具有熒光標簽的蛋白質在各類活細胞成像實驗中應用廣泛。GFP是這類熒光探針中第一個被發現的成員。天然發光的綠光熒光蛋白(GFP)最早是從水母中分離得到的,它的發現對細胞成像來說是革命性的。作為對這項工作的認可, Osamu Shimomura、Martin Chalfie和錢永健在2008年因發現和改進了GFP被授予了諾貝爾化學獎。GFP應用廣泛原因在于它的基因能在不損傷細胞的前下,在哺乳動物細胞中表達并產生一個可以發出熒光的功能蛋白。此后,人們開發了許多其它天然發光和人工改造的熒光蛋白(FPs)將GFP的基因序列突變后可以得到藍色熒光蛋白(BFP)、青色熒光蛋白(CFP)、黃色熒光蛋白(YFP)和紅色熒光蛋白(RFP)等,這使得研究者可以在同一個細胞同時使用幾種熒光蛋白探針,這些熒光蛋白被廣泛應用于細胞成像和其他許多細胞和分子生物研究。熒光蛋白的缺點在于他們的尺寸比較大(27Kd)以及其β桶裝結構。后者是其發光所必須的。為了解決這些弊端,并發揮其能與細胞特異性結合,低毒性的特點,人們開發了熒光多肽。這種熒光標簽的的尺寸更小,對目標天然行為的改變更少。雖然GFP及其衍生物對于活細胞成像是非常有價值的工具,但是通常對于待研究的細胞來說它們都是外源蛋白。許多不發熒光的天然蛋白質可以通過共價、非共價或者酶方法來標記熒光染料。這類蛋白質具備有機染料和量子點不具備的優勢。比如它們具有靶向定位亞細胞結構的能力,并且細胞毒性非常低,在細胞成像中越來越受到關注。

光敏感指示劑探針

      活細胞成像中也經常用到能夠與無機離子、金屬離子、硫醇、硫化物相互作用的熒光探針。這類探針被稱為光敏感指示劑。與特定的目標離子結合后它們熒光特性會發生改變。許多指示劑如fura-2 和indo-1能與鈣離子相互作用,它們可以用于測量細胞內的局部鈣離子濃度,也可以用于定量檢測質膜上的鈣流的改變。使用特定的指示劑也可以測量其他一些金屬離子,如鎂離子,鈉離子,鉀離子,鋅離子等。細胞器本身也也可以用特異的熒光標簽選擇性的特異標記。常見的細胞器探針有MitoTracker和MitoFluor,這兩種探針主要用來標記線粒體的熒光探針。另外的細胞器探針如LysoTracker和LysoSensor常用來標記溶酶體,BODIPY及其衍生物常用來標記高爾基體。





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